一些关于生物实验操作的相关说明
测定蛋白浓度（牛血清蛋白标定法）
牛血清蛋白(BSA)原液配置
- 将100 mg
牛血清蛋白溶液（看清稀释倍数即5X、10X等）加入 1000 mL
容量瓶去离子水定容，配置成浓度为 100 μg/mL
的牛血清蛋白原液。
蛋白浓度的标准曲线绘制
将牛血清蛋白原液分别准确稀释为10，20，30，40，50，60，70，80，90
μg/mL 标准液。
准确量取1 mL
不同浓度的牛血清蛋白溶液，向其中加入3mL考马斯亮蓝G250溶液混合均匀。25℃
水浴10min。(牛血清蛋白和考马斯亮蓝的比例可以根据实际情况调节)
另准备空白对照组：1 mL 去离子水 + 3
mL 考马斯亮蓝G250溶液。
水浴完成后立即测定波长 595 nm
处吸光度数值A595 。
浓度~吸光度回归得到标准曲线直线方程。
考马斯亮蓝
- G-250：与蛋白质结合迅速，用作蛋白质含量测定 比R—250多两个甲基
最大吸光度在 595 nm 测量范围: 0~1000 μg/mL
不适合小分子碱性多肽
- R-250：与蛋白质结合反应缓慢，可以被洗脱，用于电泳条带染色
氨基酸简称
| 丙氨酸 |
Ala |
A |
| 精氨酸 |
Arg |
R |
| 天冬酰胺 |
Asn |
N |
| 天冬氨酸 |
Asp |
D |
| 半胱氨酸 |
Cys |
C |
| 谷氨酰胺 |
Gln |
Q |
| 谷氨酸 |
Glu |
E |
| 甘氨酸 |
Gly |
G |
| 组氨酸 |
His |
H |
| 异亮氨酸 |
Ile |
I |
| 亮氨酸 |
Leu |
L |
| 赖氨酸 |
Lys |
K |
| 甲硫氨酸 |
Met |
M |
| 苯丙氨酸 |
Phe |
F |
| 脯氨酸 |
Pro |
P |
| 丝氨酸 |
Ser |
S |
| 苏氨酸 |
Thr |
T |
| 色氨酸 |
Trp |
W |
| 酪氨酸 |
Tyr |
Y |
| 缬氨酸 |
Val |
V |
| 硒代半胱氨酸 |
Sec |
U |
| 吡咯赖氨酸 |
Pyl |
O |
蛋白分离纯化浓缩
蛋白破菌纯化
- 将培养液配平用大离心机离心 4000 r 20
min (可用破菌液配平)，离心完成后去除上清液。
- 取 __25 mL
__破菌液吹吸重悬，使离心的沉淀溶解，破菌3次(次数由破菌液决定)。（一般为浓缩10倍，例：300
mL菌液，离心后用30 mL(或小于)破菌液重悬）
- 将破菌液离心取上清液，沉淀为细胞碎片。1 h 4
℃ 10000 rpm (配平用破菌液)
- 将上清液过0.45 μm的膜，分别装入锥形瓶中。
- 柱子里面加入 1 mL
Ni介质，待柱子里的酒精流完之后，用五倍柱体积水(过 0.45 μm
的膜)清洗Ni介质，再用一倍柱体积Buffer-I(过 0.45 μm
的膜，平衡镍柱)清洗Ni介质。
- 将过膜蛋白液与平衡后的Ni介质混匀，放入锥形瓶中。摇床 1
h 4 ℃ 180rpm (至少1 h)
- 蛋白纯化，将破菌液过Ni柱。
- 用 100 mL
洗杂液(Buffer-II)，弃去洗杂液体（用量为10倍柱体积）。
- 用30
mLBuffer-III洗脱Ni柱，收集洗脱液体，即目的蛋白液(用考马斯亮蓝看洗脱效果)。
- Ni柱重生：用Buffer-IⅤ洗两遍柱子，水洗两遍，75%
酒精洗两遍，20% 酒精浸泡Ni介质，将Ni柱置于4 ℃冰箱保存。
注：
- 洗杂洗脱液用量可根据考马斯亮蓝效果自行调节。
蛋白浓缩
- 将蛋白浓缩管（10
Kd）中的酒精倒干净，用水浸泡几次后加入蛋白纯化液。
- 3500 xg 4 ℃ 5 min
考马斯亮蓝检漏。
- 3500 xg 4 ℃ 45
min 配平加蛋白液直至蛋白样离心完。(可用Buffer-III配平)
- 离心至大约1 mL。
- 换液：每次加入缓冲液10mL，离心至约1mL，重复三次，相当于稀释1000倍，将高浓度咪唑洗脱下来。(考马斯亮蓝看效果)
- 浓缩到只有 2 mL 蛋白液，取出保存在4
℃冰箱，分装，长时间保存放在-40℃冰箱。
- 先用0.2M NaOH浸泡蛋白浓缩管10min，3500 xg 4 ℃ 10
min 使NaOH透过膜。
- 后用水将蛋白浓缩管洗干净后浸泡12h，换水重复三次，用75
%乙醇浸泡，存放于4 ℃冰箱。
配方
LB培养基
| 10 g/L |
蛋白胨 |
| 5 g/L |
酵母粉 |
| 10 g/L |
NaCl |
vocs培养基
| KH2PO4 |
3.8 x 0.75 |
2.85 g/L |
| K2HPO4 |
16.378 x 0.75 |
12.2835 g/L |
| (NH4)2SO4 |
1 x 0.75 |
0.75 g/L |
接种
| LB培养基 |
5 mL |
| 抗性(Amp)(1 ‰) |
5 μL |
| 甘油菌(1 ‰) |
5 μL |
注： 1. 试管可以用2 ‰，锥形瓶等大体系用1 ‰。 2.
如果想快速培养菌液，菌液比例可以提高。
摩尔质量
| Tris |
121.14 |
| Imidazole |
68.1 |
| KH2PO4 |
136.09 |
| K2HPO4 ·
3H2O |
228.22 |
| K2HPO4 |
174.18 |
| (NH4)2SO4 |
132.12 |
| Na2HPO4 |
119.96 |
| Na2HPO4·12H2O |
358.14 |
| NaCl |
58.44 |
| Gly |
75.07 |
| CH3COOH |
60.05 |
| SDS |
288.38 |
| EDTA |
292.24 |
| NiSO4·6H2O |
262.85 |
| GuHCl |
95.33 |
母液(0.5 M Tris-HCl 1.5 M
NaCl)
| Tris(0.5M) |
24.228 g |
30.285 g |
| NaCl(1.5 M) |
35.064 g |
43.83 g |
破菌缓冲液
| 50 mM Tris-HCl pH=7.5 |
|
|
3.0285 g |
6.057 g |
| 150 mM NaCl |
|
|
4.383 g |
8.766 g |
| 10 mM Imidazole |
0.3404 g |
0.6808 g |
0.3405 g |
0.681 g |
洗杂液
| 50 mM Tris-HCl pH=7.5 |
|
|
3.0285 g |
| 150 mM NaCl |
|
|
4.383 g |
| 20 mM Imidazole |
0.5464 g |
0.681 g |
0.681 g |
洗脱液
| 50 mM Tris-HCl pH=7.5 |
|
|
1.2114 g |
| 300 mM NaCl |
0.8766 |
1.7532 |
3.5064 g |
| 300 mM Imidazole |
2.0424 g |
4.086 g |
4.086 g |
终洗脱
| 50 mM Tris-HCl pH=7.5 |
|
1.2114 g |
| 150 mM NaCl |
|
1.7532 g |
| 700 mM Imidazole |
9.5312 g |
9.5312 g |
注：0.5 M Tris-HCl 1.5 M NaCl pH=7.5
稀释十倍
换液(IsPETase)
| NaCl(100 mM) |
1.1688 g |
2.3376 g |
2.922 g |
| Na2HPO4(50 mM) |
1.4196 g |
2.8392 g |
3.549 g |
| Na2HPO4·12H2O(50 mM) |
3.5814 g |
7.1628 g |
8.9535 g |
换液(Tfcut)
| Tris(20mM) |
1.2144 g |
| NaCl(100mM) |
2.922 g |
换液(LCC)
| Tris(25mM) |
1.51425 g |
| NaCl(200mM) |
5.844 g |
换液(MHETase)
| Tris-HCl(20 mM) |
0.4846 g |
0.9691 g |
1.2114 g |
| NaCl(150 mM) |
1.7532 g |
3.5064 g |
4.383 g |
BHET(DMSO)底物
注：称取0.125 g BHET装入50 mL容量瓶，加入40 mL(自行调节)
DMSO，超声至BHET溶解后，定容至50
mL。BHET溶解可能会放出大量的热导致体积增大，所以刚开始DMSO不宜加入太多。
BHET反应液
| Na2HPO4(80 mM) |
2.2714 g |
4.5427 g |
5.6784 g |
| NaCl(40 mM) |
0.46752 g |
0.93504 g |
1.1688 g |
PET反应液
| Gly-NaOH(50 mM) |
0.7507 g |
1.5014 g |
1.8768 g |
核酸胶
注：
- 溴化乙锭Ethidium
bromide(EB)：一种核酸染料，常在琼脂糖凝胶电泳中用于核酸染色。如果核酸量少，EB用量可以多加一点。
- 大胶用75 mL ，琼脂0.4 g，EB 10 μL
- 先微波加热溶解，再用水冲至不烫手，倒入制胶盒，插梳子。
平板LB培养基
| 10 g/L 蛋白胨 |
4 g |
| 5 g/L 酵母粉 |
2 g |
| 10 g/L NaCl |
4 g |
| 1.5 % 琼脂粉 |
6 g |
| 1‰抗性 |
400 uL |
注： 1. 先溶解LB培养基，然后加入琼脂粉。封口灭菌 2.
灭菌完成后 ，在超净台下加入1‰抗性。
蛋白胶电泳液
| 甘氨酸 |
18.8 g |
| Tris |
3.02 g |
| SDS |
1 g |
蛋白胶样品
蛋白胶染色脱色
- 将跑完的胶取出放入双蒸水中，微波炉加热至沸腾。
- 将双蒸水倒出，加入考马斯亮蓝染色液(50x)，沸腾后保持30s~1min。
- 放入摇床 20 ℃ 50 r 30 min。
- 将染色液收集循环使用(循环两次，一星期内，4℃)
- 加入双蒸水，加热沸腾并保持沸腾状态30 s - 1 min.
- 重新进入摇床脱色。(脱色时间看效果而定)
注： 1. 蛋白胶需浸泡在液体中 2.
跑蛋白胶时，只跑一块胶，需要在对面插一块塑料板，否则蛋白胶出现弥散现象。
Ni柱再生
配比
| 0.2 M CH3COOH 6 M GuHCl |
60 mL |
CH3COOH 0.7206 g GuHCl 34.39 g |
| 2% SDS |
90 mL |
1.8 g |
| 25% CH3CH2OH |
60 mL |
15 mL CH3CH2OH 45 mL H2O |
| 50% CH3CH2OH |
60 mL |
30 mL CH3CH2OH 30 mL H2O |
| 75% CH3CH2OH |
60 mL |
45 mL CH3CH2OH 15 mL H2O |
| 100% CH3CH2OH |
30 mL |
30 mL CH3CH2OH |
| 100 mM EDTA(pH=8.0) |
150 mL |
4.3836 g |
| 100 mM NiSO4·6H2O |
150 mL |
3.9428 g |
再生流程
- 使用0.2 M CH3COOH (含6 M GuHCl)清洗2倍柱体积。
- 使用去离子水清洗5倍柱体积。
- 使用2% SDS清洗3倍柱体积。
- 使用25% 乙醇清洗1倍柱体积。
- 使用50% 乙醇清洗1倍柱体积。
- 使用75% 乙醇清洗1倍柱体积。
- 使用100% 乙醇清洗1倍柱体积。
- 使用75% 乙醇清洗1倍柱体积。
- 使用50% 乙醇清洗1倍柱体积。
- 使用25% 乙醇清洗1倍柱体积。
- 使用去离子水清洗5倍柱体积。
- 使用100 mM EDTA(pH=8.0)清洗5倍柱体积。
- 使用去离子水清洗5倍柱体积。
- 使用100 mM NiSO4·6H2O清洗5倍柱体积。
- 使用去离子水清洗10倍柱体积。
- 再生填料可立即使用，也可以保存在20%乙醇中，保存4℃。
SDS-PAGE 蛋白胶配置
试剂清单
- 30% Acr-Bis (29:1)
- 1M Tris-HCl,pH=8.8
- 1M Tris-HCl,pH=6.8
- 10% SDS
- TEMED
- 10% APS(过硫酸铵)
保存条件： 1M Tris-HCl, pH8.8、10%
SDS、凝胶聚合催化剂和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。 30% Acr-Bis
(29:1)和TEMED 4ºC避光保存。
凝胶聚合催化剂用水配制成10%溶液后，分装成小管-20ºC保存。
Attention:
- 凝胶聚合催化剂用水配制成10%溶液后，应当-20ºC保存。同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。
- TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节凝胶聚合催化剂和TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。
- TEMED易燃，有腐蚀性，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或腐蚀其他物品。
- 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明
aps配置
10%凝胶聚合催化剂的配制：例如称取0.1g凝胶聚合催化剂，用水溶解，并定容至1ml，即为10%凝胶聚合催化剂。
分离胶
根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：
不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围：
| 6% 胶 |
50-150kD |
| 8% 胶 |
30-90kD |
| 10% 胶 |
20-80kD |
| 12% 胶 |
12-60kD |
| 15% 胶 |
10-40kD |
| 6%胶 |
5 |
10 |
15 |
20 |
30 |
50 |
| 蒸馏水 |
2.0 |
4.0 |
6.0 |
8.0 |
12.0 |
20.0 |
| 30%Acr-Bis(29:1) |
1.0 |
2.0 |
3.0 |
4.0 |
6.0 |
10.0 |
| 1M Tris,pH=8.8 |
1.9 |
3.8 |
5..7 |
7.6 |
11.4 |
19.0 |
| 10%SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.5 |
| 10%APS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.5 |
| TEMED |
0.004 |
0.008 |
0.012 |
0.016 |
0.024 |
0.04 |
| 8%胶 |
5 |
10 |
15 |
20 |
30 |
50 |
| 蒸馏水 |
1.7 |
3.3 |
5 |
6.7 |
10.0 |
16.7 |
| 30%Acr-Bis(29:1) |
1.3 |
2.7 |
4.0 |
5.3 |
8.0 |
13.3 |
| 1M Tris,pH=8.8 |
1.9 |
3.8 |
5.7 |
7.6 |
11.4 |
19.0 |
| 10%SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.5 |
| 10%APS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.5 |
| TEMED |
0.003 |
0.006 |
0.009 |
0.012 |
0.018 |
0.03 |
| 10%胶 |
5 |
10 |
15 |
20 |
30 |
50 |
| 蒸馏水 |
1.3 |
2.7 |
4.0 |
5.3 |
8.0 |
13.3 |
| 30%Acr-Bis(29:1) |
1.7 |
3.3 |
5.0 |
6.7 |
10.0 |
16.7 |
| 1M Tris,pH=8.8 |
1.9 |
3.8 |
5..7 |
7.6 |
11.4 |
19.0 |
| 10%SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.5 |
| 10%APS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.5 |
| TEMED |
0.002 |
0.004 |
0.006 |
0.008 |
0.012 |
0.02 |
| 12%胶 |
5 |
10 |
15 |
20 |
30 |
50 |
| 蒸馏水 |
1.0 |
2.0 |
3.0 |
4.0 |
6.0 |
10.0 |
| 30%Acr-Bis(29:1) |
2.0 |
4.0 |
6.0 |
8.0 |
12.0 |
20.0 |
| 1M Tris,pH=8.8 |
1.9 |
3.8 |
5..7 |
7.6 |
11.4 |
19.0 |
| 10%SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.5 |
| 10%APS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.5 |
| TEMED |
0.002 |
0.004 |
0.006 |
0.008 |
0.012 |
0.02 |
| 15%胶 |
5 |
10 |
15 |
20 |
30 |
50 |
| 蒸馏水 |
0.5 |
1.0 |
1.5 |
2.0 |
3.0 |
5.0 |
| 30%Acr-Bis(29:1) |
2.5 |
5.0 |
7.5 |
10.0 |
15.0 |
25.0 |
| 1M Tris,pH=8.8 |
1.9 |
3.8 |
5.7 |
7.6 |
11.4 |
19.0 |
| 10%SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.5 |
| 10%APS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.5 |
| TEMED |
0.002 |
0.004 |
0.006 |
0.008 |
0.012 |
0.02 |
浓缩胶
按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：
| 5%胶 |
2 |
3 |
4 |
6 |
8 |
10 |
| 蒸馏水 |
1.4 |
2.1 |
2.7 |
4.1 |
5.5 |
6.8 |
| 30%Acr-Bis(29:1) |
0.33 |
0.5 |
0.67 |
1.0 |
1.3 |
1.7 |
| 1M Tris,pH=6.8 |
0.25 |
0.38 |
0.5 |
0.75 |
1.0 |
1.25 |
| 10%SDS |
0.02 |
0.03 |
0.04 |
0.06 |
0.08 |
0.1 |
| 10%APS |
0.02 |
0.03 |
0.04 |
0.06 |
0.08 |
0.1 |
| TEMED |
0.002 |
0.003 |
0.004 |
0.006 |
0.008 |
0.01 |
通常10-30分钟内胶会凝固。
具体的凝固时间和温度及光照有关，说明书中10%凝胶聚合催化剂和TEMED的正常推荐用量是室温为25ºC时的推荐用量。
为达到与25ºC时相近的凝固时间，当室温低于25ºC时，可以适当同时加大10%凝胶聚合催化剂和TEMED的用量.
例如20ºC时建议用量是正常推荐用量的1.5倍，15ºC时建议用量是正常推荐用量的2倍。
PCR
反应体系( μL)
| ddH2O |
virable |
31 |
26 |
| dNTPs |
5 |
5 |
5 |
| PCR Stimulant |
virable |
- |
5 |
| Fastpfu buffer |
10 |
10 |
10 |
| 模板 |
1 |
1 |
1 |
| 上引 |
1 |
1 |
1 |
| 下引 |
1 |
1 |
1 |
| Fastpfu |
1 |
1 |
1 |
| total |
50 |
50 |
50 |
操作流程
- PCR
- 实验验证 取5 μL上样跑胶验证PCR是否成功
- 有条带 ------> 加1 μL DMT消化 37℃ 1 h
- 没条带 ------> 调整条件重新PCR
有条带但不单一，全部上样跑胶（大孔），切胶，回收胶
- 回收PCR产物
- 无缝连接 5 μL 产物（3 μL 基因（短）+ 2μL 质粒（长）） + 5 μL Mix 50℃
15 min
- 转化 T1/DH5α 感受态细胞 1管可分两管用
取感受态冰上放5 min
转入10 μL无缝连接产物，轻轻的 边搅匀边吹吸。
_轻轻的_
冰上放30 min
42 ℃ 热激 T1：30s
DH5α：90s （必须迅速）
立即取出，放冰上2 min
加入500 μL LB/SOC， 37℃ 180 rpm 1h
离心取样 450 μL 上清 重悬菌体涂平板
- 挑单克隆验证 保甘油菌 提质粒/菌液送测
- 测序正确的质粒，接菌，提质粒，转化入BL21(DE3) ,步骤同上，热激90
s
流程
- 涂平板
- 挑单克隆 37℃ 220rpm 12h
- 保甘油菌，1％菌液量转接到大瓶，抗性1‰（例：300 mL培养基，转接3
mL菌液，300μL抗性）
- 接菌后37℃，220 rpm 培养 3 h 20 min
,测OD600，数值应该在1.1左右 。添加1
‰IPTG，降温到16℃诱导表达20h。（摇床门打开降温快，IPTG解冻后不溶可超声）
- 破菌纯化浓缩保存蛋白
甘油制备
- 向100 mL玻璃瓶中加入80 mL甘油
- 加入适量水，微波加热。
- 待甘油变得不粘绸，用水定容到100 mL
- 灭菌。（瓶口需要拧松）